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    大鼠低氧誘導因子1a(HIF-1α)ELISA 檢測試劑盒說明書

    發布時間: 2010/8/4  點擊次數: 1161次
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    詳細介紹:

     

    大鼠低氧誘導因子1aHIF-1α)ELISA 檢測試劑盒

    本試劑僅供研究使用  標本:血清或血漿

     

    試驗原理

    HIF-1α試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA.已知HIF-1α濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將HIF-1α和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然后加入底物AB,和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中HIF-1α的濃度呈比例關系。

     

    試劑盒內容及其配制

    試劑盒成份(2-8℃保存)

    96孔配置

    48孔配置

    配制

    96/48人份酶標板

    1塊板(96T

    半塊板(48T

    即用型

    塑料膜板蓋

    1

    半塊

    即用型

    標準品:800pg/ml

    1瓶(0.6ml

    1瓶(0.3ml

    按說明書進行稀稀

    空白對照

    1瓶(1.0ml

    1瓶(0.5ml

    即用型

    標準品稀釋緩沖液

    1瓶(5ml

    1瓶(2.5ml

    即用型

    生物素標記的抗HIF-1α抗體

    1瓶(6ml

    1瓶(3.0ml

    即用型

    親和鏈酶素-HRP

    1瓶(10ml

    1瓶(5.0ml

    即用型

    洗滌緩沖液

    1瓶(20ml

    1瓶(10ml

    按說明書進行稀釋

    底物A

    1瓶(6.0ml

    1瓶(3.0ml

    即用型

    底物B

    1瓶(6.0ml

    1瓶(3.0ml

    即用型

    終止液

    1瓶(6.0ml

    1瓶(3.0ml

    即用型

    標本稀釋液

    1瓶(12ml

    1瓶(6.0ml

    即用型

     

    自備材料

    1.  蒸餾水。

    2.  加樣器:5ul10ul50ul100ul200500ul1000ul

    3.  振蕩器及磁力攪拌器等。

     

    安全性

    1.  避免直接接觸終止液和底物AB。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。

    2.  實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

    3.  不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

     

    操作注意事項

    1.  試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。

    2.  實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。

    3.  不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

    4.  使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物AB液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。

    5.  使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

    6.  洗滌酶標板時應充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。

    7.  底物A應揮發,避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

    8.  加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

    9.  按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

     

    樣品收集、處理及保存方法

    1、  血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

    2、  血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

    3、  細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

    4、  組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液

    5、  保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

     

    試劑的準備

    1.  標準品:標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:

    800 pg/ml

    6號標準品)

    原倍濃度不用稀釋直接加入50ul

    400 pg/ml

    5號標準品)

    100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液

    200 pg/ml

    4號標準品)

    100ul5號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    100 pg/ml

    3號標準品)

    100ul4號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    50 pg/ml

    2號標準品)

    100ul3號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    25 pg/ml

    1號標準品)

    100ul2號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    0 pg/ml

    (空白對照)

    原始濃度不用稀釋直接加入50ul

     

    2.  洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。

     

     

    操作步驟

    1.  使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產生加樣上的誤差。

    2.  根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定,能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液11稀釋后加入50ul于反應孔內。

    3.  加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。

    4.  甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。

    5.  每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。

    6.  甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。

    7.  每孔加入底物AB50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。

    8.  取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結果。

    9.  450nm波長處測定各孔的OD值。

     

    建議使用的實驗方案

     

    標準品濃度(pg/ml

     

    A

    800

    800

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    B

    400

    400

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    C

    200

    200

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    D

    100

    100

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    E

    50

    50

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    F

    25

    25

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    G

    0

    0

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    H

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

     

     

    局限

    6號標準品以上的結果為非線性的,根據此標準曲線無法得到的結果。

     

    試劑盒性能

    1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990

    2. 特異性:不與其它細胞因子反應。

    3. 重復性:板內、板間變異系數均小于10%

     

    結果 判 斷

    1、儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD

     

    2、以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的HIF-1α標準品濃度為橫坐標(X),做得相應的曲線,樣品的HIF-1α含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

     

    3檢測值范圍:0-800pg/ml

     

    4、敏感度: 1.0 pg/ml

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