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免疫組化操作規(guī)程
發(fā)布時間： 2011/4/27 點擊次數(shù)： 1634次提 供 商： 研域（上海）化學(xué)試劑有限公司 資料大小： 圖片類型： 下載次數(shù)： 0 次 資料類型： 瀏覽次數(shù)： 1634 次 相關(guān)產(chǎn)品： 詳細介紹： 一、實驗器材
微波爐、吹風(fēng)機、組化筆、濕盒、烤箱、振蕩器、染缸、光學(xué)顯微鏡、純木漿衛(wèi)生紙、計時器和通風(fēng)櫥等。
二、實驗原理與意義
免疫組織化學(xué)又稱免疫細胞化學(xué)，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡）的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等）。
三、試劑配制
0.01 M PBS（pH 7.34 ）：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加雙蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2M PB （pH 7.4）＝5.93 g NaH2PO4·2H2O＋58.02 g Na2HPO4·12H2O in 1000 ml雙蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH2PO4·2H2O：15.6 g in 500 ml ddH2O；B. 0.2 M Na2HPO4·12H2O：71.632 g in 1000 ml dH2O）。
Citrate Buffered Saline（0.01 M檸檬酸緩沖液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH2O（A.Citrate acid（檸檬酸）：10.5 g 加雙蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（檸檬酸鈉）：29.41 g加雙蒸水至1000 ml）。
細胞通透液：由終濃度分別為0.3%雙氧水和0.3%Triton X-100混合而成。配制方法是先用微波加熱的36 ml PBS，再接著加120 ul TritonX-100，并加熱一會兒，冷卻至臨用前加0.4 ml 30％H2O2。
5％羊血清或封閉血清，用PBS稀釋。
含0.03％H2O2的0.05％DAB（避光）：用20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。
一抗、二抗均用PBS稀釋。
Xylene、梯度Ethanol（100％×2、95％、80％、70％、50％）、雙蒸水、中性樹膠（封裱劑）。
蘇木精染液：
四、操作步驟
1、脫蠟、水化
60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes；
100% absolute ethanol：2 ×5 minutes；
95% ethanol 2 minutes；
80% ethanol 2 minutes；
70% ethanol 2 minutes；
distilled water:5 min；
PBS洗3次×3 min。
2、細胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶
用封閉通透液浸潤切片30 min（RT避光）。配法是用預(yù)熱40 ml PBS加120ul TritonX-100加熱幾分鐘后，臨用前加400 ul 30％H2O2。
PBS溶液洗3次×3 min。
3、抗原修復(fù)暴露抗原決定族
切片放入0.01 M檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6.0）后，在微波爐里高火4 min至沸騰后，再加熱約6 min×4次，每次間隔補足液體，防止干片。
4、封閉非特異性蛋白
PBS溶液洗3次×3 min；
將切片取出,周圍水分用濾紙吸干,用組化筆在組織周圍畫上圈,在圓圈內(nèi)組織滴入5%羊血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中,室溫30（10～30）min；
5、一抗孵育
甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗（1：250、500、1000）后，放入濕盒中室溫1小時，然后4度過夜，從冰箱中取出需37 ℃復(fù)溫45 min。
6、二抗孵育
將一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次；
用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入37 ℃恒溫烤箱中30 min（回收）。
用PBS洗5次×5 min；
7、SP反應(yīng)
加入SP后放入37度烤箱中30 min。
用PBS洗5次×5 min；
8、顯色
加入DAB（快速滴入，觀察染色情況，倒掉染液），顯色時間控制在約5 min（3～10 min），由鏡下觀察顏色控制時間。0.05％DAB（避光）（1:20儲備液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB儲備液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保存。
9、復(fù)染、脫水、透明、封片
用PBS 3次×3min后，用雙蒸水洗5 min；
加一大滴蘇木素染液，胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染20 s后自來水沖洗，雙蒸水洗5 min，再用PBS返藍5 min。
脫水：50% ethanol 1-2 min，
70% ethanol 1-2 min
95% ethanol 1-2 min；
95% ethanol 1-2 min；
100% absolute ethanol: （1-2） min；
100% absolute ethanol: （1-2） min。
透明：Xylene 1×（1-2） min→Xylene 2×（1-2） min
封片：中性樹膠。
五、注意事項
蘇木素復(fù)染時間需要摸索，尤其陽性染色也在細胞核上。
DAB顯色時間需要達到*化，鏡下觀察達到陽性染色明顯但背景不太深。
抗體孵育時間和抗體濃度需要摸索。尤其一抗孵育在4度過夜。
切片脫蠟和水化要充分；加反應(yīng)液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，但又防止干片；用組化筆畫圈時盡量畫大一點，否則墨水排斥液體，引起片周邊干片。
片子著色不均勻的原因如下：
脫蠟不充分。可以60 ℃烤20 min，立即放入新鮮的xylene1；
水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇；
抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑；
抗體孵育時，切片放傾斜；
抗體孵育后PBS沖洗不充分。
制片厚薄不均勻等問題。染片盒不平，切片傾斜。
一抗從4 ℃拿出后，為什么有人說要37度復(fù)溫，目的是什么？
一方面，防止切片從4 ℃直接放入PBS易脫片；
另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4 ℃和37 ℃度時分子運動方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？
抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制；
一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；
內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高，需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色
非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強封閉效果；
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